MAKALAH BIOTEKNOLOGI

rekayasa genetik dengan biotransfor
berupa plasmid

Disusun oleh : Kelompok 1

Christiani Sianturi (4113141013)

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI MEDAN

2013

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Genetika yakni ilmu pengetahuan mengenai keturunan, adalah disiplin ilmu yang yang mendasar dalam biologi. Genetika tahap pertama telah berkembang pada tahun 1969, untuk mempermudah para mahasiswa dalam mempelajari genetika yang didominasi oleh matematika, dilakukan sistem pengajaran penyelesaian soal. Pada tahun –tahun berikutnya , peralatan yang mempermudah telah tersedia, dengan kalkulator mikroelektronik yang relatif murah, pemahaman dasar-dasar genetika mengalami pendalaman yang sangat besar dan era baru rekayasa genetika pun di mulai. (Schaum,1999)

Perkembangan teknologi rekayasa genetika saat ini luar biasa cepatnaya, sehingga banyak jurnal atau majalah semipopuler bermunculan bagai jamur karena memang informasi tentang temua-temuan baru di bidang ini selalu ada dari ke hari. Tulisan ini mengajak pembaca untuk mengenal teknologi DNA secara sederhana sebagai pembuka wawasan untukk mengetahui lebih jauh lagi tentang teknologi tersebut. (Muladno,2010)

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana menjelaskan sifat plasmid?

2. Bagaimana struktur plasmid?

3. Bagaimana klasifikasi plasmid?

4. Bagaimana menjelaskan plasmid sebagai biotranspor?

1.3 Tujuan

1. Untuk menjelaskan sifat plasmid.

2. Untuk menjelaskan struktur plasmid.

3. Untuk menjelaskan klasifikasi plassmid.

4. Untuk menjelaskan plasmid sebagai biotranspor.

BAB II

ISI

2. PLASMID

2.1 Sifat Umum Plasmid

Sifat khas suatu organisme diturunkan dari generasi ke generasi melalui gen. Gen adalah unit dasar hereditas yang tersusun secara linear (berjejer lurus) dan terdapat pada lokus tertentu dari kromosorn. Kromosom mengandung semua informasi yang diperlukan untuk kehidupan organisme, antara lain dalam proses pembelahan sel. Pada organisme prokariot sel yang diturunkan merupakan salinan yang tepat sarna dari sel induknya. Material genetik dari semua gen dan kromosom adalah asarn deoksiribonukleat (DNA). DNA menyimpan informasi genetik yang spesifik, yang menentukan sifat khas suatu organisme. Perbedaan informasi yang dikode oleh DNA menyebabkan perbedaan sifat biologik di antara organisme. Fungsi biologik kromosom adalah penyimpanan in·formasi genetik, pewarisan informasi genetik dan ekspresi

pesan genetik yang pada dasarnya sarna di semua organisme (Kane dan Kandel, 1985).

Di dalarn sitoplasma sel bakteri selain material genetik yang berupa kromosom dapat pula ditemukan material genetik lain yaitu plasmid. Plasmid ini merupakan DNA berserat ganda yang berbentuk lingkaran dan mempunyai kemarnpuan untuk bereplikasi sendiri tanpa tergantung dari replikasi kromosom (Broda, 1979; Hardy, 1983)

Gen yang dibawa oleh plasmid tidak mutlak diperlukan bagi kelangsungan hidup sel bakteri sehingga biasanya bakteri dapat hidup tanpa plasmid (Broda, 1979; Wilson) walaupun demikian plasmid perlu mendapat perhatian karena dapat memindahkan sifat resistensi antibiotik di antara bakteri yang bersifat patogen bagi hewan dan manusia. Di samping itu plasmid juga dapat mengkode produksi toksin dan protein lain yang dapat meningkatkan virulensi bakteri patogen seperti enterotoksin, bakteriosin, hemolisin, beberapa antigen permukaan dan eksotoksin.

Beberapa plasmid lain mempunyai sifat yang lebih menguntungkan, yaitu mengkode antibiotik yang dapat mengontrol bakteri atau menyebabkan bakteri dapat menguraikan ataumemecahkansenyawa yang berupa polutan seperti herbisida (Hardy, 1983).

2.2 Struktur Plasmid

Plasmid mempunyai berat molekul yang berkisar antara 1 x 106 - 200 x 106 dalton yaitu 0.04 % - 8 % dari ukuran kromosom Escherichia coli (berat molekul 2.7 x 106 dalton, panjang 1.3 mm). Di dalam bakteri, kebanyakan mo1eku1 plasmid berada dalam bentuk "covalently closed circle" (CCC). Artinya tidak terdapat putusan pada salah satu dari kedua serat polinukleotida yang membentuk serat ganda.

Kebanyakan mo1eku1 plasmid yang diiso1asi dari bakteri mempunyai bentuk mo1ekul "supercoiled" yang mempunyai "superhelical twist". ]3entuk molekul "open circular" tanpa "superhelical twist" terjadi apabila salah satu serat molekul CCC terputus. Bila kedua serat polinukleotida terputus pada tempat yang tepat berhadapan atau sangat dekat satu dengan lain sehingga ikatan hidrogen antara basa yang berpasangan kurang kuat untuk menahan ikatan antara kedua serat tersebut, maka akan terbentuk molekul "linear" (Hardy, 1983).

Gambar. Bentuk rnoleku1 plasmid

2.3 Klasifikasi Plasmid

Bermacam-macam kriteria digunakan untuk mengk1asifikasikan plasmid. Klasifikasi yang paling penting adalah berdasarkan sifatnya. plasmid-R menunjukkan resistensi terhadap satu jenis"antibiotik atau 1ebih, plasmidCol mengkode suatu protein antibakteria1 yang disebut ko1isin. Plasmid"degradatif mengkode berbagai enzim katabo1isme dan plasmid virulensi meningkatkan patogenisitas bakteri mela1ui berbagai cara (Hardy, 1983).

Satu plasmid selain mengkode"sifat umum yang berkaitan dengan k1asifikasinya, dapat juga membawa sifat lain yang tidak berhubungan sama sakali dengan sifat pertama. Sebagai contoh ada plasmid Ent yang selain mengatur produksi enterotoksin juga membawa sifat resistensi antibiotik (Gyles et aI, 1978). Berdasarkan ukurannya plasmid dibagi menjadi dua golongan yaitu plasmid besar dan plasmid kecil. Plasmid besar mempunyai berat molekul lebih dari 40 x 10 6 dalton dan terdiri dari 100 - 200 gen. Plasmid kecil mempunyai berat molekul di bawah 10 x 106 dalton dan terdiri dari kurang lebih 15 gen. Plasmid kecil ini umumnya mempunyai jumlah salinan yang banyak .

2.4 Replikasi Plasmid

Replikasi plasmid terjadi secara independen dari replikasi kromosom. Walaupun demikian di antara keduanya tetap ada hubungan. Laju perturnbuhan bakteri dapat berubah-ubah sesuai dengan keadaan lingkungan. Plasmid dapat dipert.ahankan pada laju perturnbuhan yang berbeda. Hal ini menunjukkan bahwa replikasi plasmid sejalan dengan sintesa komponen sel yang lain. Penyesuaian replikasi plasmid terhadap laju perturnbuhan induk semangnya dicapai dengan mengontrol inisiasi replikasi plasmid. Perbedaan dalarn laju inisiasi juga menyebabkan

perbedaan dalarn jumlah plasmid.

Replikasi plasmid besar sinkron dengan replikasi romosom dan diharnbat oleh mutasi bakterial yang disebabkan oleh temperatur yang mencegah terjadinya replikasi DNA. Sebaliknya replikasi plasmid kecil tidak terpengaruh oleh mutasi yang sarna, tetapi dihambat oleh mutasi pada DNA polimerase I yang tidak mempengaruhi plasmid besar.

Proses replikasi dibagi menjadi tiga tahap dasar yaitu inisiasi, pemanjangan rantai polinukleotida dengan sintesa semi konservatif dan terminasi.

Pada tahap inisiasi, replikasi dimulai pada suatu titik yang spesifik dan kemudian menuju satu arah menjauh dari titik asalnya (unidireksional). Kejadian pertama adalah transkripsi suatu daerah pada plasmid yang dekat titik asal dan dikatalisa oleh enzim DNA dependent RNA polimerase induk semang. Transkripsi ini menghasilkan RNA primer untuk sintesa DNA selanjutnya.

Mula-mula sintesa DNA dikatalisa oleh DNA polimerase I mulai dari gugus 3'OH pada ujung RNA primer dan diteruskan ke arah 5'--n' untuk kurang lebih 500 nukleotida. Pada tahap perpanjangan rantai, replikasi yang terputus- putus dari serat lain dimulai. RNA primer yang

pendek diperpanjang oleh holoenzim DNA polimerase III untuk membentuk fragmen Okazaki yang terdiri dari kurang lebih 1000 basa. Fragmen yang berdekatan kemudian disatukan oleh DNA ligase.

Tahap terminasi adalah pembentukan dua molekul plasmid yang terpisah, masing-masing satu molekul CCC. Kedua serat induk berpisah sebelum percabangan replikasi mencapai terminus/asal replikasi. Pada waktu serat ganda hampir terlepas untaiannya dan percabangan replikasi hampir mencapai terminus, efek aktifitas DNA girase adalah untuk melepas sarna sekali kedua serat induk sehingga terbentuk dua molekul anak. Celah antara serat yang· baru kemudian ditutup dengan reaksi yang memerlukan DNA polimerase I dan DNA ligase. setelah celah tertutup, molekul sebentar tanpa "supercoil" (dalam keadaan relaks) tetapi kemudian "supercoiling" dibentuk oleh DNA girase (Hardy, 1983).

2.5 Transfer Plasmid

Pada organisme prokariot informasi genetik (DNA) yang terkandung dalam plasmid dapat dipindahkan dari sel donor ke sel resipien, yang memungkinkan sel resipien memperoleh sifat baru. Kebanyakan plasmid pada bakteri dapat ditransfer melalui konjugasi. Plasmid konjugatif harus mempunyai seperangkat gen yang mengatur replikasi dan mekanisme transfer, yaitu gen tra. Jumlahnya paling sedikit 13 buah dan tersusun sebagai suatu operon. Fungsi qen ini adalah untuk pembentukan pili, penempatan pili dan proses transfer DNA.

Transfer plasmid melalui konjugasi dimulai dengan penonjolan pilus. Ujung pilus dari bakteri donor akan melekat pada dinding bakteri resipien dan berkaitan dengan reseptor khusus. pili kemudian akan mengalami retraksi sehingga terjadi kontak langsung di antara sel. Kontak lang sung ini menyebabkan DNA terbuka pada tempat tertentu.

Proses ini diikuti oleh transfer DNA dari sel donor ke sel resipien. Serat DNA yang ditransfer tidak berupa serat ganda, tetapi hanya serat tunggal dan selalu dimulai dari ujung 5'. Kemudian baik pada donor maupun resipien akan terjadi sintesa serat DNA pelengkap sehingga terbentuk kembali plasmid yang berserat ganda (Hardy, 1983).

Gambar . Transfer DNA plasmid melalui konjugasi

Plasmid yang tidak konjugatif bertindak sebagai replikon yang hanya mengatur proses replikasi dan segregasi. Dengan tidak terdapatnya faktor transfer pada plasmid ini, maka transfer dari satu sel ke sel lain tidak dapat terj adi. Plasmid seperti ini. tergantung pada mekanisme lain untuk transfer seperti mobilisasi oleh plasmid lain atau transduksi (Wilson dan Miles, 1975) .

Mobilisasi plasmid terjadi apabila suatu se1 bakteri mengandung dua plasmid, yang satu konjugatif dan yang lain tidak. Plasmid yang pertama akan menimbu1kan transfer dari plasmid kedua secara simultan, yaitu yang kedua "dimobilisasi". Transduksi terjadi apabila bakteri mendapat infeksi bakteriofag. Selama infeksi bakteriofag plasmid kadang-kadang diselaputi oleh selaput pembungkus fagphage-coat dan membentuk suatu partikel transduksi (transducing particle). Partikel ini dapat menginjeksi plasmid ke dalam sel bakteri resipien yang cocok (Hardy, 1983).

2.6 Plasmid-R Dan Resistensi Terhadap Antibiotik Pada Enterobacteriaceae

Resistensi terhadap antibiotik adalah sifat yang ditentukan secara genetis. Beberapa bakteri secara alami resisten terhadap antibiotik tertentu. Dengan adanya terapi antibiotik, kemudian timbul resistensi padatan pada koloni yang semula peka. Resistensi ini diperoleh karena adanya mutasi pada kromosom bakteri atau melalui transfer plasmid-R dari galur (strain) bakteri resisten ke galur yang peka.

Mutasi kromosomal yang menyebabkan suatu populasi bakteri menjadi resisten jarang terjadi. Sebaliknya resistensi dapat dipindahkan dengan cepat di dalam suatu populasi bakteri melalui transfer plasmid-R. Di samping itu "lalu lintas" plasmid pada populasi bakteri dapat menyebabkan penyebaran yang meluas dari resistensi. Pemakaian antibiotik berlebihan menciptakan lingkungan yang menguntungkan bakteri yang resisten karena bakteri yang peka mati. Hal ini membentuk reservoir plasmid-R pada flora normal. Karena plasmid-R biasanya

menentukan resistensi terhadap sejumlah antibiotik, kontak yang lama dengan salah satu antibiotik pun dapat menambah jumlah bakteri yang multiresisten .

2.7 Ekologi Enterobacteriaceae dan Plasmid-R

Bakteri dari famili Enterobacteriaceae ditemukan pada hewan dan manusia, terutama di daerah usus. Famili ini terdiri dari beberapa genus. Di dalam usus Escherichia coli merupakan flora normal. Da1am keadaan tertentu bakteri ini dapat menyebabkan infeksi saluran kemih atau

diare. Salmonella adalah organisme patogen bagi hewan dan manusia. Individu yang terinfeksi dapat mengekskresikan bakteri ini secara terus-menerus dalam tinja (faeces) , menyebabkan kontaminasi lingkungan dan mentransfer infeksi kepada individu lain. Shigella merupakan penyebab disentri basiler pada manusia. Penyakit ini biasanya dihubungkan dengan higiene yang buruk. Di usus Proteus dan Klebsiella bersifat komensal. Dalam keadaan tertentu bakteri ini dapat menyebabkan infeksi saluran kemih atau bersifat oportunistik.

Penggunaaan antibiotik secara meluas dan sembarangan untuk profilaksi dan tujuan pengobatan menyebabkan timbulnya bakteri yang resisten Resistensi antibiotik sering ditemukan

pada bakteri dari famili Enterobacteriaceae. Pada Escherichia coli yang diisolasi dari hewan yang diberi makanan tambahan rnengandung antibiotik, resistensi mencapai 40 - 100 % dan kebanyakan organisme tersebut mengandung plasrnid-R (Dhillon dan Dhillon, 1981; Shimoda

et aI, 1983). Bakteri dari farnili Enterobacteriaceae yang mernbawa plasmid-R sering diisolasi dari berbagai jenis hewan, manusia dan lingkungan. Salmonella yang mengandung plasmid-R dari sapi. Bakteri 'tersebut juga diisolasi dari kambing (Kumar dan Misra, 1983), babi (Bineva dan Korudzhiiski, 1983; Kumar dan. Misra, 1983; Said.alet al; 1983;. Semjen dan'Pesti, 1982) dan ayam (Dhillon' dan, Dhil.lon, 1981; Nazer, 1981) Beberapa peneliti juga menemukan Escherichia coli yang membawa p1asmid-R pada hewan yang mempunyai hubungan erat dengan manusia seperti anjing (Monaghan et aI, 1981; Moss dan Frost, 1984), kucing (Moss dan Frost, 1984) dan burung piara (Kinjo et aI, 1982). Dari anjing yang menderita enteritis akut Minton et al (1983) mendapatkan mikroba tinja yang multiresisten. Setelah hewan sehat kemba1i sifat ini hilang walaupun sejumlah kecil bakteri resisten masih ditemukan sampai satu tahun kemudian. Resistensi terhadap antibiotik jarang ditemukan pada hewan percobaan karena adanya prinsip menghindari penggunaan antibiotik pada hewan yang akan digunakan untuk penelitian. Adanya resistensi antibiotik dapat diamati pada Escherichia coli yang diisolasi dari koloni hewan percobaan yang diberi antibiotik. Resistensi ini menghi1ang sete1ah pember ian antibiotik dihentikan (Shimoda et aI, 1983). Pada Escherichia coli yang diisolasi dari enam spesies burung liar kejadian resistensi terhadap antibiotik relatif rendah. Nakamura et al (1982) menyimpulkan bahwa burung liar tidak ter1alu berperan dalam penyebaran plasmid-R. Echerichia coli yang resisten terhadap antibiotik dan p1asmid-R sudah tersebar 1uas da1am 1ingkungan manusia seperti 1imbah peternakan sapi dan babi (Bineva et aI, 1983; Hanzawa et aI, 1984), air limbah (Mach dan Grimes, 1982) dan permukaan air sungai (Lantos et aI, 1983).

Selain Escherichia coli dari 1imbah air juga diisolasi Salmonella enteritidis dan Proteus mirabilis yang membawa plasmid-R. Dari bahan pakan asa1 ternak Biru et al (1981) mengisolasi Escherichia coli dan Salmonella typhimurium yang resisten terhadap dua jenis antibiotik.

Resistensi terhadap antibiotik juga ditemukan pada Escherichia coli yang diisolasi dari tukang jagal dan peternak babi (Saida et aI, 1983). Dari penderita berbagai macam penyakit infeksi yang sedang diberi terapi dengan antibiotik Mehrotra et al (1984) mengisolasi Escherichia coli, Enterobacter sp., Proteus sp. Dan Klebsiella sp. yang membawa plasmid-R.Timbulnya resistensi diduga akibat penggunaan antibiotik yang sembarangan.

2.7.1 Sifat Genetik plasmid-R

Plasmid-R terdiri atas dua bag ian yang dapat dibedakan yaitu RTF (resistance transfer factor) yang bertanggung jawab atas konjugasi dan determinan resistensi. Pada bag ian determinan resistensi terdapat semua gen yang mengatur resistensi terhadap antibiotik, kecuali

gen resistensi terhadap tetrasiklin yang terdapat pada bagian RTF (Hardy, 1983) .

Pada Escherichia coli bag ian RTF dan determinan resistensi biasa ditemukan sebagai satu unit. Pada Proteus kedua bagian ini dapat ditemukan sebagai dua plasmid yang terpisah (Davis et aI, 1973; Wilson dan Miles, 1975). Suatu plasmid-R dapat menyebabkan bakteri menjadi resisten terhadap satu antibiotik atau terhadap beberapa antibiotik secara pada umumnya mentransfer semua marker (petanda) resistensinya sebagai satu unit. Walaupun demikian segregasi yang spontan pada plasmid dapat terjadi. Hasilnya sering kali adalah faktor RTF sulr strr camr dan RTF tetr. Frekwensi segregasi spontan ini bervariasi tergantung dari sel induk semangnya. Frekwensi ini tertinggi pada Salmonella dan terendah pada Escherichia coli (Lewin, 1977). Rekombinasi dapat terjadi apabila suatu sel bakteri mengalami superinfeksi oleh dua molekul plasmid-R yang masing-masing membawa determinan resistensi yang berbeda. Frekwensi rekombinasi rendah, tetapi hal ini memungkinkan p1asmid-R untuk mendapatkan atau kehilangan marker resistensi tertentu (Lewin, 1977). Menurut Hanzawa et al (1984) resistensi yang paling umum ditemukan pada Escherichia coli yang diiso-1asi dari limbah peternakan babi dan sapi adalah terhadap streptomisin, sulfonarnida dan tetrasiklin. Pada isolat dari limbah peternakan babi ditemukan 28 pola resistensi dan yang paling umum amalah Sm-Su. Dari limbah

peternakan sapi ditemukan 11 pola, yang paling umum adalah Sm. Selain pola tersebut juga ditemukan pola resistensi terhadap enam jenis antibiotik (Ap-Cm-Km-Sm-Su-Tc) Pola ini pernah ditemukan oleh Ishiguro et al (1982) pada Escherichia coli dan Salmonella typhimurium dari tinja sapi. Hal ini menunjukkan adanya kemungkinan transfer resistensi di antara kedua bakteri tersebut di alami.

2.7.2 Organisasi Genom

Molekul DNA yang dapat bereplikasi sebagai unit genetik pada bakteri disebut replikon. Pada beberapa bakteri replikon hanya berupa kromosom (genom), tetapi sebagian besar bakteri replikon terdiri dari kromosom dan plasmid.

2.7.3 Kromosom

Genom bakteri bervariasi dari 0,4x10⁹ Dalton sampai 8,9x10⁹ Dalton. Jumlah DNA dalam genom menentukan jumlah maksimum yang informasi genetik yang dapat dikode. Sebagian besar bakteri memiliki genom haploid (kromosom tunggal) dan sirkuler. Namun beberapa bakteri gram positif seperti Borrelia dan Streptomyces memiliki kromosom linier. Bakteri gram negatif Agobacterium tumefaciens memiliki kromosom linier dan sirkuler. Bakteri E. coli saluran pencernaan memiliki ukuran genom 3X10⁹ Dalton dengan 4.500 kilo pasang basa (kbp). Genom E. coli tersebut hanya 0,1% (dibandingkan genom manusia), tetapi mampu mengkode ribuan polipeptida.

Kemampuan bakteri bereplikasi sangat cepat. E. coli mampu mereplikasi DNA hanya dalam waktu 40 menit. Namun pada bakteri yang tumbuh cepat replikasi dapat dimulai sebelum replikasi DNA selesai.

2.7.4 Dna (Asam Nukleat)

Asam nukleat merupakan polimer nukleotida. Setiap nukleotida terdiri atas fosfat, pentosa, dan basa. Pentosa asam nukleat adalah ribosa atau deoksiribosa, sedangkan basa asam nukleat adalah adenin dan guanin (purin) dan timin, urasil, dan sitosin (pirimidin). DNA berbeda dengan RNA dalam 2 hal, struktur dan komposisi asam nukleat. Struktur DNA adalah pita heliks ganda (Gambar 8.1), sedangkan RNA adalah pita heliks tunggal (beberapa virus memiliki RNA ganda). Komposisi gula pentosa dan basa pirimidin DNA adalah deoksiribosa dan timin dan sitosin. Komposisi gula pentosa dan basa pirimidin RNA adalah ribosa dan urasil dan sitosin. DNA bakteri baik kromosom maupun plasmid berbentuk sirkuler.

2.7.5 Konjugasi

Konjugasi memerlukan kontak langsung antara donor dan resepien. Kontak terjadi melalui jembatan konjugasi (pili) maupun tanta jembatan konjugasi. Donor merupakan bakteri yang memiliki kemampuan mendonorkan materi genetik baik melalui jembatan konjugasi (pili) ataupun tidak. Kemampuan tersebut terletak pada plasmid. Oleh karena itu plasmid yang mampu mendonorkan materi genetik disebut plasmid F atau plasmid seksual.

Setiap bakteri F+ memiliki 1—3 pili yang mampu mengikat protein membran sel resepien untuk memulai proses inisiasi konjugasi (Gambar 8.4). Setelah terjadi kontak, maka pili berubah fungsi menjadi jembatan konjugasi. Jembatan konjugasi biasanya memendek untuk mempermudah proses konjugasi. Plasmid bakteri donor memisah menjadi 2 pita tunggal dan salah satu untai plasmid ditransfer ke bakteri resepien. Pada proses transfer pita DNA plasmid, bakteri donor segera mengganti pita terdonor dengan mekanisme replikasi. Ketika bakteri resepien menerima DNA, maka dia juga melakukan replikasi untuk DNA baru sehingga DNA plasmid donor menjadi 2 untai.

Gambar : Proses konjugasi plasmid.

Plasmid F pada E. coli dapat dapat berintegrasi dengan kromosom bakteri (Gambar 8.5). Hal ini dapat terjadi karena kromosom dan plasmid F E. coli memiliki elemen urutan insersi. Integrasi intragenetik disebut mutasi horisontal dan menghasilkan rekombinan yang mempunyai kemampuan mentransfer kromosom (konjugasi) tinggi.

Gambar 7.5 Mutasi horisontal. F^- adalah sel nonkonjugatif, F⁺ adalah sel konjugatif, Hfr sel rekombinan dengan kemampuan frekuensi tinggi konjugasi, F’ adalah sel berplasmid dengan gen kromosomal.

Konjugasi tanpa jembatan konjugasi terjadi pada bakteri gram positif. Bakteri gram positif menghasilkan adesin untuk agregasi antara sel donor dan sel resepien, tetapi tidak melibatkan pili. Pada beberapa species Streptococcus resepien menghasilkan feromon seksual untuk menarik Streptococcus donor mendekat dan melakukan kontak.

Transformasi

Pada transformasi bakteri donor melepaskan sepotong pita ganda DNA dan bakteri resepien menerima/menyerap hanya 1 pita DNA saja. Materi genetik yang ditransfer melalui transformasi dapat DNA kromosom maupun DNA plasmid. Transformasi alami ditemukan pada Streptococcus pneumoniae, Haemophilus, Neisseria, Bacillus, dan Staphylococcus. Bakteri yang biasanya tidak mampu (tidak kompeten) mengambil DNA dari lingkungan dapat menjadi kompeten dengan manipulasi eksperimental, seperti kejutan elektrik voltase tinggi, kejutan kalsium, penambahan urutan nukleotida tertentu. Bakteri kompeten juga dapat menyerap semua DNA bakteriofag (transfeksi) maupun seluruh plasmid dan mereplikasikannya di dalam sel. Namun jika yang terserap hanya sebagian materi geneti, maka materi genetik tersebut tidak terekspresi dan tereplikasi sebelum terintegrasi ke dalam replikon.

2.7.6 Transduksi

Pada transduksi, bakteriofag berfungsi sebagai “carrier” DNA dari donor ke resepien. Ketika bakteriofag menginfeksi bakteri donor, maka bakteri donor mengalami lisis (mati) dan bakteriofag melepaskan diri. Namun ketika bakteriofag menginfeksi bakteri resepien, maka bakteri resepien tidak mengalami lisis.

Transduksi dibedakan menjadi transduksi umum (generalized transduction), transduksi abortif (abortive transduction), dan transduksi khusus (specialized transduction). Transduksi umum menghasilkan rekombinan yang mampu mengekspresikan DNA donor, sedangkan transduksi abortif tidak. Transduksi khusus berbeda dengan transduksi umum dalam hal bakteriofag yang mampu menginfeksi hanya bakteriofag tertentu.

2.7.7 Rekombinasi

Rekombinasi melibatkan pemutusan DNA resepien dan pengabungan DNA donor ke DNA induk menghasilkan hibrida (molekul rekombinan). Enzim khusus yang berperan dalam rekombinasi DNA adalah eksonuklease, endonuklease, polimerase, dan ligase.

Rekombinasi umum (generalized recombination) melibatkan DNA donor dan resepien yang memiliki urutan homolog. Perubahan resiprokal dapat terjadi pada rekombinasi umum. Produk gen recA sangat penting dalam rekombinasi umum, tetapi produk gen lainnya juga berperan. Rekombinasi lokasi khusus (site-specific recombination) hanya dapat terjadi pada lokasi khusus pada DNA donor dan resepien. Produk gen recA tidak berperan dalam rekombinasi lokasi khusus. Integrasi molekul DNA bakteriofag 1 ke kromosom E. coli pada lokasi khusus (attachment site; att) merupakan contoh rekombinasi lokasi khusus.

2. 8 Bahan, Teknik Isolasi Dan Karakterisasi Gen Virulen Kromosom

2.8.1 Plasmid, Strain Bakteri Dan Kondisi Kultur

Sel-sel A. tumefaciens dikultur pada/dalam medium minimal LB (2) atau AB (13) dengan suhu 28° C, sementara strain Eschericia coli ditumbuhkan pada/dalam medium LB atau TB (Terrific Broth) (2) pada suhu 37° C. Konsentrasi antibiotik (mg/liter) yang digunakan dalam media adalah sebagai berikut, kecuali dinyatakan lain; kanamisin (100), neomisin (100), gentamisin (30), ampisilin (100), dan tetrasiklin (10).

2.8.2 Pengujian Kemampuan Pelekatan Bakteri

Bakteri berlabel radioaktif ditambahkan ke dalam suspensi sel mesofil daun Zinnia (Zinnia elegans), dan dipantau proses pelekatannya. Sel mesofil daun Zinnia dipersiapkan sesegera mungkin sebelum digunakan sebagai berikut; Daun termuda yang dilebarkan maksimal dibilas dengan air distilasi dan dihomogenisasi secara perlahan dalam garam Murashige-Skoog (MS) (pH 5.7) dengan mortar dan alat penumbuk. Homogenat dilewatkan dalam lapisan kasa 250 µm, dan sel-sel yang dikeluarkan ditampung dalam saringan Miracloth. Sel-sel disuspensi dalam garam MS (pH 5.7) dengan konsentrasi sel 2x10⁵ sampai 3x10⁵ sel/ml. Suspensi yang dihasilkan oleh cara ini sebagian besar meliputi sel-sel tunggal, dengan pecahan seluler yang sangat kecil.

Bakteri diberi label dengan cara menginokulasi sebuah koloni tunggal ke dalam 0,5 ml medium minimal AB yang disuplemen dengan 2 µCi [α-³²P] dCTP dan menumbuhkan kultur tersebut semalaman pada suhu 30° C. Bakteri tersebut dibilas dalam garam larutan penyangga (buffer) fosfat dan disuspensi kembali dalam 0.5 ml garam larutan penyangga fosfat. Bakteri yang berlabel ditambahkan ke dalam suspensi sel tanaman pada konsentrasi akhir sekitar 10⁶ bakteri/ml, menghasilkan rasio bakteri terhadap sel tanaman sekitar 3:1. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 27° C dengan pengocokan yang beragam. Jumlah bakteri yang ditempelkan pada sel tanaman ditentukan setelah penyaringan campuran bakteri dengan sel tanaman melalui saringan berpori 20µm. Bakteri bebas, tidak termasuk sel tanaman yang ditempeli bakteri, dapat melewati saringan. Setelah dicuci dengan garam larutan penyangga fosfat 20 ml, saringan itu lalu ditempatkan dalam tabung kecil (scintillation vials) dan radioaktivitasnya dihitung dalam scintillation counter.

2.8.3 Isolasi DNA

Sejumlah kecil dari total DNA, termasuk Ti plasmid dan DNA kromosom dari Agrobacterium disiapkan dengan metode Kado dan Liu (41). Sel-sel ditumbuhkan semalaman dalam L-Broth pada suhu 28° C hingga densitas optik 0.8 pada 600 nm dan dijadikan pelet melalui sentrifugasi pada 2.5 k x g selama 7 menit. Pelet sel disuspensikan dalam 1 ml larutan penyangga E (40 nM Tris-asetat, pH 7.9, mengandung 2 mM EDTA). Sel-sel tersebut dihancurkan dengan cara menambahkan 2 ml larutan penghancur (3% SDS dalam 50 mM Tris-NaOH, pH 12.6), dan dicampur dengan pengadukan singkat. Larutan tersebut dipanaskan pada suhu 65° C selama 10 menit dalam water bath dan ditambahkan dua volume larutan fenol: kloroform (1:1, v/v). Larutan tersebut diemulsi dengan cara mengocoknya secara singkat, dan emulsi tersebut dipecah dengan sentrifugasi (3.5 kx g, 15 menit, 4° C). Fase cair bagian atas dialirkan ke dalam tabung baru dan DNA dijadikan pelet dengan menambahkan 0.1 volume natrium asetat 3 M (pH 4.8) dan 2.5 volume etanol. DNA dalam bentuk pelet disuspensi kembali dalam 100 ml larutan penyangga TE (Tris-HCl 10 nM, pH 8.0, mengandung EDTA 1 mM).

Plasmid lainnya, seperti pUC18, diisolasi dengan prosedur lisis alkalin SDS (68). Sel bakteri dikultur semalaman dalam media LB atau TB yang mengandung antibiotik yang sesuai. Kultur tersebut (1.5 ml) disentrifugasi dan peletnya disuspensi dalam 100 µl larutan penyangga (Tris-HCl 50mM, pH 8.0, mengandung glukosa 50 mM dan EDTA 10 mM). Setelah disimpan dalam es selama 5 menit, suspensi tersebut ditambahkan dengan 200µl larutan penghancur (NaOH 0.8 M, Triton X-100 4%), dicampur dengan cara dibalik beberapa kali dan ditempatkan dalam es selama 5 menit. Kemudian, ditambahkan 150 µl natrium asetat 3 M (pH 4.8) dan ditempatkan dalam es selama 5 menit. Campuran itu disentrifugasi pada suhu ruangan selama 5 menit. Supernatannya dituangkan dalam tabung microcentrifuge bersih, dan ditambahkan 1 volume (450 µl) isopropanol, dicampur dengan cara membalik tabung beberapa kali, diikuti dengan inkubasi dalam suhu ruangan selama 5-10 menit. Larutan tersebut disentrifugasi pada 13 k x g selama 10 menit untuk mengubah plasmid DNA menjadi pelet. Setelah pengeringan, plasmid DNA disuspensi kembali dalam 50 µl larutan TE. Jika perlu, RNA yang mengkontaminasi pada endapan dihilangkan dengan prosedur berikut. DNA plasmid dilarutkan dalam 900 µl larutan TE, kemudian ditambahkan 100 µl Rnase A (dipanaskan, 100 µg/ml). Larutan tersebut diinkubasi pada suhu 37° C selama 30 menit, dan kemudian disentrifugasi untuk menghilangkan bahan yang tidak dapat larut. Larutan polietilen glikol 6000 (20% dalam NaCl 2.5 M, 600 µl) ditambahkan ke dalam supernatan. Setelah inkubasi dalam es selama dua jam, larutan tersebut disentrifugasi pada 13 k x g selama 5 menit. Endapannya dilarutkan dalam 500 µl larutan TE dan diekstrak dengan fenol, fenol:kloroform (1:1, v/v) dan kloroform, masing-masing satu kali. Setelah itu, DNA dalam lapisan air diendapkan dengan etanol.

Sejumlah besar DNA kromosom Agrobacterium disiapkan dengan metode terlampir (2). Sel-sel bakteri dikultur hingga jenuh dalam 100 ml medium LB. Sel-sel tersebut dijadikan pelet dengan sentrifugasi 3.5 k x g selama 10 menit, dan kemudian disuspensi kembali dalam 9.5 ml larutan penyangga TE. Suspensi bakteri ditambahkan dengan 0.5 ml SDS 10% dan 50 µl proteinase K (20mg/ml), dicampur rata dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37° C. NaCl (5 M, 1,8 ml) dan larutan CTAB/NaCl (1.5 ml) ditambahkan, diaduk perlahan dan diinkubasi pada suhu 65° C selama 20 menit. Campuran itu ditambahkan dengan kloroform:isoamilalkohol dengan volume yang sama (24:1, v/v) dan disentrifugasi pada 3.5 k x g selama 10 menit pada suhu ruangan, sampai lapisan-lapisannya terpisah. Lapisan bagian atas dipindahkan ke tabung bersih menggunakan pipet polietilen berpori lebar. DNA dijadikan pelet dengan penambahan 0.6 volume isopropanol dan disentrifugasi pada 8 k x g selama 5-10 menit. Pelet DNA dicuci dengan etanol 70%, dikeringkan dan disuspensi kembali dalam 4 ml larutan penyangga TE, diikuti dengan penambahan 4.3 g CsCl dan 200 µl ethidium bromida (10mg/ml). Campuran itu kemudian dialirkan ke tabung centrifuge yang dapat ditutup rapat (sealable centrifuge tube) dan diputar dalam rotor vertikal selama 18 jam pada 600 k x g pada suhu 15° C. Dibawah sinar UV pita DNA kromosomal yang ada dalam tabung centrifuge dipindahkan dengan menggunakan alat suntik dan diekstraksi dengan campuran TE:isoamilalkohol (1:1, v/v). Kemudian, larutan DNA dipisahkan dengan dialisis (dialyzed) semalaman dengan 2 liter larutan penyangga TE.